Factors Affecting In Vitro Direct Shoot Regeneration in the Greek Strawberry Tree, Arbutus andrachne L.

Abstract

Arbutus andrachne L., the Greek Strawberry tree, (Ericaceae) is a small tree distributed naturally throughout many regions in the Mediterranean and southwest Asia. It is also part of the Palestinian flora and known for its medicinal value. Recently populations of A. andrachne in Palestine are facing severe genetic erosion due to extensive agricultural and human activities, over-exploitation, overgrazing, habitat fragmentation, and woody cutting by local people. Plant tissue culture offers a powerful alternative for the massive production of many endangered and difficult-to-propagate plants. Direct shoot regeneration aims to produce shoots directly from different explants such as leaves, hypocotyls, cotyledons, and roots. The main objective of this work was to investigate the effect of concentration of different growth regulators and explant type and age on A. andrachne direct shoot regeneration. Motherstock plants of A. andrachne were initiated from seeds. Seeds were cold stored and were soaked in 5.0 mg/ml GA3 for seven days followed by culturing on WP media. Old leaves, young leaves, hypocotyls, cotyledons, and roots were cultured on WP media supplemented with different concentrations of TDZ (1.0, 1.5, 2.0 mg/l) and 0.5 mg/l NAA. The cotolydonary explants showed significant differences among media with different TDZ concentrations; media that contains 1.0mg/l TDZ + 0.5 mg/l NAA, or 1.5 mg/l TDZ+ 0.5 mg/l NAA gave the highest shoot regeneration (4.0 shoots/explant,3.9 shoots/explant), while media with 2.0 mg/l TDZ+ 0.5 mg/l NAA gave the least number of shoot regeneration (0.6 shoots/explant). Other explant types showed no significant differences on media with different TDZ concentrations, but old leaves gave the highest regeneration on media with 1.0 mg/l TDZ + 0.5 mg/l NAA (0.4 shoots/explant), young leaves gave the highest regeneration on media with 1.5 mg/l TDZ + 0.5 mg/l NAA (2.3 shoots/explant), and hypocotyls highest response was on media with 1.5 mg/l TDZ + 0.5 mg/l NAA (3.7 shoots/explant), while roots showed no response in all concentrations. Cotyledonary segments and hypocotyl gave the highest number of shoots (4.0 shoots, 3.0 shoots, respectively) on media with 1.0 mg/l TDZ and (3.9 shoots, 3.8 shoots, respectively) on media with 1.5 mg/l TDZ .Young leaves gave highest number of shoots 2.1 shoots on media with 2.0 mg/l while old leaves show very low response and roots did not give any direct shoot regeneration in all PGRs concentrations. At 1.0 mg/l TDZ, cotyledons gave the highest proliferation 47.6%, hypocotyls gave 28.6%, then new leaves 42.8%, old leaves and roots showed no response. When TZD level increased to 1.5 mg⁄l TDZ cotyledons gave 42.9% proliferation, hypocotyls gave 38%, then new leaves 33.3%, old leaves 19% but no response was seen in roots. Whereas in media with 0.5mg/l NAA and 2.0mg/l TDZ, hypocotyls gave responsive by 28.6%, cotyledons gave 9.5% and young leaves gave 9.5%, 4.8% for old leaved and no responsive in roots. The rooting medium of WP supplemented with 15 g⁄l sucrose and 1.5 mg⁄l IBA gave 100% responsiveness. This study can be used in genetic transformation of A. andrachne tree.

شجرة القيقب أو شجرة الفراولة الإغريقية تنتمي إلى عائلة الخلنجيات، تنتشر هذه الشجرة على امتداد منطقة البحر الأبيض المتوسط وجنوبي غربي آسيا. على غرار كثير من نباتات فلسطين الطبية يواجه القيقب خطر الانقراض بسبب تعرضه للعديد من الظروف القاسية والتي تشمل: الممارسات الزراعية والبشرية الخاطئة، الرعي الجائر، الإفراط في استغلال الأراضي الزراعية وقطع الأشجار. يعتبر التكثير الدقيق للنباتات داخل المختبر بديل فعال لتكثير النباتات المهددة بالانقراض. التكثير المباشر داخل المختبر يهدف إلى إنتاج أجيال جديدة وتنميتها مباشرة من خلال استخدام أجزاء مختلفة من نفس النبات. الهدف الأساسي للدراسة الحالية هو اختبار تأثير اختلاف تركيز منظمات النمو المدعمة للوسط الغذائي، واختلاف أجزاء النبات المستخدم في التكثير المباشر للقيقب. لتأسيس النبات داخل المختبر تمت معالجة بذور القيقب بالتبريد لمدة 7 أيام على درجة حرارة 4 سيليسيوس وغمسها في GA3 بتركيز 5.0 ملغم/مل ثم زراعتها على الوسط الغذائي WP حيث كانت نسبة الإنبات 93%. تمت زراعة أجزاء مختلفة من القيقب المنبت في المختبر على الوسط الغذائي WP المدعم بمنظم النمو (1.0، 1.5، 2.0 ملغم/ لتر) TDZ، بالإضافة إلى 0.5 ملغم/ لتر من منظم النمو NAA. الكوتيليدون أعطى اختلاف إحصائي بالنسبة للتراكيز المختلفة من ال TDZ، حيث الوسط الغذائي WP المدعم ب 1.0 ملغم/لتر TDZ و0.5 ملغم/ لتر NAA بالإضافة إلى الوسط الغذائي WP المدعم ب 1.5 ملغم/ لتر TDZ و0.5 ملغم/ لتر NAA أعطوا أكبر عدد من الفروع(4.0 و 3.9 فرع، بالترتيب) الوسط الغذائي WP المدعم ب 2.0 ملغم/ لتر TDZ و 0.5 ملغ/لتر NAA أعطى نتائج ضعيفة لم تتجاوز ال 0.6 فرع)، بينما الوسط الغذائي الذي لا يحتوي على منظمات النمو لم يعطي أي نتيجة. أجزاء النبات الأخرى لم تظهر اختلافات إحصائية على الوسط الغذائي المدعم بالتراكيز المختلفة، ولكن أعلى عدد فروع نتج من الأوراق القديمة كان على الوسط الغذائي WP المدعم ب 1.0 ملغم/ لتر TDZ و0.5 ملغم/ لتر NAA (0.4 فرع)، الأوراق الجديدة أعطت أعلى تفرع (2.3 فرع) على الوسط الغذائي WP المدعم ب 1.5 ملغم/ لتر TDZ و0.5 ملغم/ لتر NAA ,أعلى استجابة في الهايبوكوتيل كانت على الوسط الغذائي WP المدعم ب 1.5 ملغم/ لتر TDZ و0.5 ملغم/ لتر NAA (3.7فرع)، أما بالنسبة للجذور فكانت النتيجة سلبية. الكوتيليدون والهايبوكوتيل أعطوا أعلى نسبة تفرع (4.0فروع، 3.0 فروع بالترتيب) على الوسط الغذائي WP المدعم ب 1.0 ملغم/ لتر TDZ و0.5 ملغم/ لتر NAA، و (3.9 فرع, 3.8 فرع بالترتيب) على الوسط الغذائي WP المدعم ب 1.5 ملغم/ لتر TDZ و0.5 ملغم/ لتر NAA. الأوراق الجديدة أعطت أعلى تفرع (2.1 فرع) على الوسط الغذائي WP المدعم ب 2.0 ملغم/ لتر TDZ و0.5 ملغم/ لتر NAA. في حين أن الأوراق القديمة أظهرت استجابة ضعيفة والجذور لم تستجب أبدا على مختلف التراكيز. في الوسط الغذائي WP المدعم ب 1.0 ملغم/ لتر TDZ أعطت أجزاء الكوتيليدون أعلى نسبة تفرع 47.6%، الهايبوكوتيل أعطت 28.6%، الأوراق الجديدة 42.8%، بينما الأوراق القديمة والجذور لم تعطي نتائج. عند رفع تركيز ال TDZ إلى 1.5 ملغ/لتر، أعطت الكوتيليدون نسبة تفرع 42.9%، الهايبوكوتيل أعطت 38%، الأوراق الجديدة 33.3%، الأوراق القديمة 19%، والجذور لم تعطي نتائج. عند تركيز 2.0 ملغ/لتر TDZ الكوتيليدون أعطت نسبة تفرع 9.5%، الهايبوكوتيل أعطت 28.6%، الأوراق الجديدة 9.5%، الأوراق القديمة 4.8%، والجذور لم تعطي نتائج. كما أعطى النبات نسبة تجذير 100% باستخدام الوسط الغذائي WP بإضافة 15 غم سكروز و 1.5 غم/ لتر من هرمون ال IBA . هذه الدراسة يمكن أن تستخدم في تكثير نبات القيقب في المختبر بأعداد كبيرة وتعديلها جينياُ.