Comparison of different Brucella DNA markers as genus-specific PCR targets to improve detection sensitivity

Abstract

Brucellosis is a disease that causes serious problems for animals and human in many regions of the world, particularly, developing countries. The causative agent of brucellosis is the pathogenic bacteria called Brucella. The molecular techniques especially PCR considered as a standard method to detect Brucella because of their sensitivity. However, most primers for the detection of Brucella exhibiting variable sensitivity. Therefore, there is a need to design novel primers that target multi-sequences to obtain higher sensitivity than other existing primers used for Brucella detection. In this study, the de novo repeats finder tool softberry was used to mine for repetitive elements from the referenced genome (Brucella melitensis bv. 1 str. 16M) sequences. Two PCR reactions using IS1 and IS2 sets of primers were performed to assess their sensitivity in detecting Brucella. The designed short IS1 and long IS2 pair of primers were used to detect the insertion sequence IS711. The bands observed on agarose gel electrophoresis exhibited similar sensitivity of both B4-B5 and IS2 primers. However, IS1 primers possess lower sensitivity. By analyzing the structures of the targets using mfold online software, the IS711 targeted sequence has a complex secondary structure with a strong stem-loop hairpin structure that leads to obstacle the binding of the primer to its binding site and may lower the sensitivity of the PCR. We conclude that the secondary structure of the target at annealing step plays a critical role in the binding of the primers to the desired binding sites, affecting their sensitivity. We highly recommend analyzing the secondary structure of the selected target as an important criterion in designing a PCR reaction.

ملخص

الحمى المالطية هي مرض يسبب مشاكل جدية في الحيوان والانسان في مناطق مختلفة من العالم، وخاصة في الدول النامية. إن المسبب الممرض للحمى المالطية هي بكتيريا تدعى البروسيلا. إن التقنيات الوراثية التشخيصية خاصة البلمرة منها تعتبر من التقنيات الأساسية لفحص البروسيلا نظراً لدقتها. ولكن معظم المبلمرات المستخدمة تمتلك حساسية مختلفة بين بعضها البعض. لذلك، وجدت الحاجة لتطوير مبلمرات جديدة تستهدف مناطق متكررة في الجينوم والتي تظهر حساسية أعلى من الموجودة حالياً للكشف عن بكتيريا البروسيلا. في هذه الدراسة تم استخدام برنامج خاص للبحث عن السلاسل المتكررة وتم الكشف عن سلاسل متكررة خاصة بجينوم البروسيلا التي تصيب الاغنام. استخدم زوجان من المبلمرات من أجل عمل تقنية البلمرة وتقييم دقة الكشف عن بكتيريا البروسيلا. زوجا المبلمرات القصيرة IS1 والكبيرة IS2 - والتي تم تصميمها في هذه الدراسة – استخدمت من اجل الكشف عن القطعة الجينية المتحركة IS711. إن القطع التي تم ملاحظتها باستخدام تقنية فصل الآجار بالشحنات الكهربائية توضح التشابه ما بين حساسية الفحص بين كل من المبلمرات B4-B5 و IS2. ولكن المبلمرات IS1 لم تعطي حساسية مشابهة وانما أقل من ازواج المبلمرات السابقة. بناء على ذلك، تم فحص الشكل الجزيئي للسلاسل الجينية باستخدام برنامج الحاسوب mfold ووجد بأن مناطق ارتباط المبلمرات على السلاسل الجينية تحتوي على شكل مشبكيّ معقد والتي تؤدي الى عرقلة ارتباط المبلمر بالمنطقة المطلوبة. الأمر الذي يقلل من حساسية تقنية البلمرة. هنا نستطيع القول بأن الشكل الجزيئي للسلاسل الجينية المرغوب الكشف عنها يلعب دوراً مهماً في ارتباطهما في مرحلة الاتصال داخل تقنية البلمرة وبالتالي تؤثر على مدى حساسية الفحص. اننا ننصح وبشدة تحليل الشكل الجزيئي للسلاسل المستهدفة في عملية البلمرة قبيل البدء في تصميم المبلمرات الخاصة لذلك.